【兽医肿瘤前沿】犬肝细胞癌中信号转导及转录激活因子 3 的过度 ...

胡璠

犬肝细胞癌中信号转导及转录激活因子 3 的过度活化及其预后意义

翻译：王新颖 胡璠

关键词：犬 | 肝细胞癌 | 免疫组织化学 | pSTAT3

摘要

磷酸化信号转导及转录激活因子 3（pSTAT3）与肿瘤的抗凋亡、细胞增殖、侵袭和迁移有关，其在人类恶性肿瘤以及犬类黑色素瘤中具有预后意义。然而，pSTAT3 在犬类肝脏组织中的意义尚未得到评估。本研究的目的是通过免疫组织化学分析比较其在犬类正常、非肿瘤性肝病和肝细胞癌（HCC）组织中的表达情况。此外，还研究了 pSTAT3 免疫染色与临床病理因素之间的关联。总共检查了 68 个犬类肝脏组织，包括 10 个正常肝脏组织、30 个非肿瘤性肝病组织和 28 个 HCC 组织，结果显示各组间 pSTAT3 免疫染色存在显著差异（p<0.001）。此外，高 pSTAT3 免疫染色与肿瘤大小（>5 厘米）显著相关（p=0.041），与转移（p=0.046）也存在关联。此外，Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，高 pSTAT3 免疫染色与无病生存期（p=0.013）和总体生存期（p=0.011）的不良预后存在相关性。这些研究结果表明，STAT3 的过度激活与犬类肝细胞癌（HCC）的不良预后相关。因此，pSTAT3 被认为是犬类 HCC 的一个潜在预后标志物和治疗靶点。

1 | 引言

信号转导及转录激活因子（STAT）蛋白在细胞生长、转化、分化及存活等过程中发挥着重要作用。它们通过细胞因子、生长因子或激素激活的 Janus 激酶（JAK）和 STAT 通路被激活，并发生磷酸化[1, 2]。磷酸化的 STAT 蛋白形成二聚体。这些二聚体在细胞核内移动并聚集，它们作为识别特定 DNA 元件的转录因子发挥作用[3]。

持续激活的 STAT3 会导致裸鼠肿瘤形成 [3]。在所有 STAT 蛋白中，STAT3 主要因其与肿瘤的关联而为人所知。人类恶性肿瘤据报道通过酪氨酸残基 705 的磷酸化而增加了激活的 STAT3 的含量，并且其预后意义已被提出 [4-9]，包括在肝细胞癌（HCC）中也是如此 [10, 11]。在犬类中也有类似的报道，报告称肿瘤中磷酸化 STAT3（pSTAT3）蛋白含量增加 [12-14]。有趣的是，最近的一项犬类研究提出，STAT3 的过度激活与犬类黑色素瘤的预后相关 [15]。然而，pSTAT3 在犬类 HCC 中及其预后价值尚未得到证实。已证明的。

犬类肝胆肿瘤较为罕见，约占所有犬类肿瘤的 1%。肝细胞癌（HCC）是犬类肝胆肿瘤中最常见的原发性恶性肿瘤[16]。HCC 可根据形态学亚型进行分类。已确定了三种形态学亚型：巨块型、结节型和弥漫型[16]。根据最近的一份报告，在这些亚型之间并未观察到预后的差异[17]。在巨块型亚型中，受影响肝叶的部分或完全肝叶切除是最佳治疗方法，预后良好[18]。此外，最近的研究表明，切除的完整性与预后无关[17， 19]。HCC 的几个预后因素已被提出，包括血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）的水平以及受影响的肝叶[17， 18]。右叶和中央侧肝肿瘤由于肝手术暴露的困难以及肝脏血管解剖结构的原因，预后较差[17， 18]。关于 HCC 的其他治疗方法的有效性，包括化疗、放疗以及辅助治疗手段，在很大程度上仍不为人所知。

在人类和犬类中，pSTAT3 在肿瘤组织中高度表达，并且被认为是一个预后因素。本研究旨在通过蛋白质印迹法确认 pSTAT3 的存在，并通过免疫组织化学法评估其在正常肝脏、非肿瘤性肝病以及肝细胞癌（HCC）组织中的表达情况。此外，本研究的目的是评估 pSTAT3 的预后价值，并将其免疫染色结果与临床病理因素进行比较。本研究为进一步探究 pSTAT3 在犬类肝细胞癌治疗中的作用奠定了基础。

2 | 材料与方法

2.1 | 组织样本与临床数据

作为对照样本的正常犬肝脏组织是从首尔国立大学兽医学院兽医外科系饲养的五只 1 岁健康且未阉割的雄性比格犬身上获取的。这些组织是在对另一只实验对象（SNU-200709-4-5）实施安乐死之后收集的。该实验与肝脏或肿瘤无关，也不预计会对本研究的结果产生影响。对于免疫化学实验中，每只狗的肝脏组织均采用无菌方式通过断头法采集了两份。将 10 份肝脏组织样本在室温下用 10%中性缓冲福尔马林固定至少 48 小时，并制成石蜡包埋块。通过苏木精和伊红染色进行组织病理学确认，这些样本均为正常组织。此外，还采集了一份较小的肝脏组织用于蛋白质印迹实验，将其迅速冷冻在液氮中，然后在 -80°C 下保存直至用于实验。

2018 年 1 月至 2019 年 1 月期间，在首尔国立大学医学教学医院接受手术治疗的 58 只宠物犬的肝脏病变组织被采集。2024. 所有病变组织均在首尔国立大学兽医病理学实验室或 IDEXX 实验室通过组织病理学检查进行诊断。其中，30 例患有非肿瘤性肝病，28 例患有肝细胞癌（HCC）。切除病变肝脏组织后，收集了部分肝组织。所有组织均按照正常肝脏组织的固定和切片方法进行固定和切片，用于免疫组织化学检测，并且部分组织被保存在 -80°C 下用于蛋白质印迹实验。

收集了肝细胞癌（HCC）患者的临床数据，包括病史、血液学检查结果、肿瘤位置、形态学亚型、肿瘤大小（≤5 厘米、>5 厘米）以及转移性病变等信息。这些患者接受了各种筛查检查，包括 X 光检查、超声检查或计算机断层扫描，确诊为恶性肿瘤的患者被排除在本研究之外。肿瘤位置被分为三组：左侧、中央或右侧（20）。左侧部分包括左外侧叶、左内侧叶和尾状叶的乳头状突起；中央部分包括方叶和右内侧叶；右侧部分包括右外侧叶和尾状叶的乳头状突起。在一项关于肝脏肿瘤形态学亚型的研究中，巨块型被定义为局限于单个叶内的大而孤立的肿块，偶尔会涉及其他叶。结节型表现为多个叶内存在分散的多灶性结节。弥漫型特征是肿瘤细胞浸润整个或部分肝脏[16]。肿瘤大小该研究是基于一项针对肝细胞癌（HCC）的人类 pSTAT3 研究结果，采用 5 厘米的截断值进行分类的[11]。首尔国立大学的机构动物护理和使用委员会伦理审查并批准了研究方案和程序（SNU-240301-1）。

2.2 | 蛋白质印迹法

选取了一块正常组织样本以及一名被诊断患有肝细胞癌（HCC）患者的组织样本用于蛋白质印迹法检测。使用 RIPA 缓冲液（Pierce；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科学公司）以及含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯市）和 PhosSTOP 磷酸酶抑制剂（罗氏诊断公司，美国印第安纳波利斯市）的试剂盒对蛋白质进行匀浆和提取。采用标准的二喹啉甲酸测定法（Pierce，纽约州罗克兰市）对蛋白质进行定量。在上样前，每种定量为 30 μg 的蛋白质与 Laemmli 的 SDS 样品缓冲液（4 倍浓缩，还原型）（GenDEPOT，得克萨斯州巴克）混合，然后在 95°C 下煮沸 5 分钟进行变性。变性的蛋白质经过 10% 的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SMOBIO，台湾新竹）处理，并转移到疏水性聚偏二氟乙烯膜（0.45 μm）（GenDEPOT，得克萨斯州巴克）上。为了进行封闭处理，使用 5% 的脱脂乳（BD，新泽西州富兰克林湖）在 Tris 缓冲液中加入 0.1% 的吐温 20（TBST）进行 1 小时室温封闭。将膜在 4°C 下与鼠抗 STAT3（1：1000，#9139，Cell Signaling Technology，马萨诸塞州）一起孵育过夜。兔抗 pSTAT3（Y705）（1:1000，#9145，Cell Signaling 技术公司，马萨诸塞州，美国）和小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体（1:5000，sc-47778，Santa Cruz Biotechnology 公司，加利福尼亚州，美国）作为蛋白质负载对照。随后，它们在室温下与二抗孵育 1 小时；兔抗 pSTAT3（H+L）-HRP（1:5000，SA002-500，GenDEPOT 公司，巴克，得克萨斯州，美国）用于 pSTAT3，兔抗 STAT3（H+L）-HRP（1:5000，SA001-500，GenDEPOT 公司，巴克，得克萨斯州，美国）用于 STAT3 和β-肌动蛋白。在每次孵育步骤之间，膜用 TBST 清洗，并通过化学发光使用 ECL 检测试剂（Advansta，曼洛帕克，加利福尼亚州，美国）进行显影。图像使用 ImageQuant LAS 4000 mini 生物分子成像仪（GE Healthcare Biosciences，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）捕获。

2.3 | 免疫组织化学

将犬的肝脏组织用 10% 中性缓冲福尔马林固定，并用石蜡包埋，然后用切片机切成 3 微米厚的切片。切片组织在 65°C 下孵育，并用二甲苯两次脱蜡处理，每次 5 分钟。然后在分级乙醇（100% 两次 5 分钟；90%、80% 和 70% 各 3 分钟）中复水。使用 10mM 柠檬酸（pH6.0）缓冲液在 2100 压力锅（PickCell 实验室，阿姆斯特丹，荷兰）中进行抗原修复处理 20 分钟。切片组织用 0.3% 过氧化氢溶液封闭 30 分钟。这些组织用 10% 正常山羊血清（ab7481，Abcam，马萨诸塞州剑桥市）处理 20 分钟以阻断非特异性结合，并在 4°C 的潮湿环境中与兔抗 pSTAT3（Y705）（1:300，#9145，Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯）一起孵育过夜。阴性对照组织用兔 IgG 同型对照（1:300，#3900 Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯）孵育以排除第二抗体的非特异性结合。使用犬的皮脂腺腺体腺癌（AGASACA）样本作为阳性对照[21]。将这些组织与二抗（生物素化的山羊抗兔 IgG（H+L）（即用型），ab64256，Abcam 公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）一起在室温下孵育 1 小时，随后用 3，3'-二氨基苯idine（DAB 显色底物试剂盒，ab64238，Abcam 公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）处理 10 分钟以显现抗原的色泽。使用 Mayer's 藓酚染色法对组织进行复染，然后在逐渐稀释的乙醇（90% 3 分钟和 100% 两次，每次 5 分钟）中脱水组织，并在二甲苯中两次脱水 5 分钟。在每次操作之间，组织用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次。使用奥林巴斯 BX50F4 显微镜（奥林巴斯，日本东京）和适当的光滤镜（福州市图森公司）进行显色。

2.4 | 免疫组化定量分析染色

pSTAT 免疫染色采用半定量评估方法，其依据是基于比例和强度等级计算得出的免疫染色评分。此评估基于人类肝细胞癌（HCC）的免疫染色结果[22]。比例和强度等级仅针对核染色细胞进行评估。通过五个代表性高倍视野（400×）中阳性核染色的百分比来确定各等级的比例：1 级（0 - 25%）、2 级（26 - 50%）、3 级（51 - 75%）和 4 级（> 75%）。评估染色强度的平均值并将其分类为 0（阴性）、1（轻微染色）、2（弱染色）、3（中度染色）或 4（强染色）。最终的染色评分计算为比例和强度等级之和，从而得出四个主要评分：总和为 1 - 2 的评分 1、总和为 3 - 4 的评分 2、总和为 5 - 6 的评分 3 和总和为 7 - 8 的评分 4（图 1）。≤2 的评分被认为是低免疫染色，而> 2 的评分被认为是高免疫染色。免疫染色由两名未接触组织病理学信息的观察者进行。

2.5 | 回顾性数据

手术后，所有患者均在术后两周进行了随访检查，随后每 3 - 6 个月进行一次常规复查。进行了胸部 X 光检查（至少包括三个视图）和腹部超声检查以评估转移和复发情况。如有必要，还会进行计算机断层扫描、细针穿刺和活检。

2.6 | 统计分析

采用线性相关性检验，评估了 pSTAT3 免疫染色（低表达与高表达）与肝脏组织类型（正常肝脏、非肿瘤性肝病或肝细胞癌）之间的相关性。使用 Shapiro-Wilk 和 Kolmogorov-Smirnov 检验分析了 pSTAT3 免疫染色与年龄之间的相关性，并使用 Mann-Whitney U 检验比较了根据 pSTAT3 免疫染色的不同变量。采用卡方检验和 Fisher 确切概率法评估 pSTAT3 免疫染色与临床病理因素之间的关联。

图 1 | 采用 3,3'-二氨基联苯胺和苏木精作为复染剂对磷酸化信号转导及转录激活因子 3（pSTAT3）进行免疫染色的评分系统（A-D）。通过四个主要评分来确定细胞核中 pSTAT3 染色的结果，同时考虑比例等级和强度等级（评分 1：比例总和为 1 - 2，评分 2：比例总和为 3 - 4，评分 3：比例总和为 5 - 6，评分 4：比例总和为 7 - 8）。（原始放大倍数：×400）

基于 pSTAT3 免疫染色结果，对患有肝细胞癌（HCC）的犬只构建了无病生存期（DFS）和总体生存期（OS）的 Kaplan-Meier 生存曲线。DFS 定义为从首次手术到检测到局部复发或转移的时间段。在 DFS 研究中，无法进行随访且直至研究结束或死亡时仍未发生转移或复发的犬只被纳入随访终止（censored）。OS 定义为从初次手术到因肝细胞癌死亡的时间段。在 OS 研究中，存活的犬只、失去随访或死于非肝细胞癌原因的犬只被排除在外。对于所有统计分析，p 值 < 0.05 被认为具有统计学意义，并使用 SPSS 软件（IBM 公司，纽约州阿蒙克市，美国）进行。

3 | 结果

3.1 | 临床信息

本研究纳入了 58 只客户拥有的犬只以及 5 只比格犬。表 1 展示了犬只的基本资料，包括年龄、性别、品种和组织病理学信息。所有犬只的中位年龄为 11 岁（范围 1 - 17 岁），主要品种为马尔济斯犬（17 只）、西施犬（7 只）和玩具贵宾犬（7 只）。根据世界小型动物兽医协会的指南，非肿瘤性肝病分为三组：炎症（n = 18）、空泡性肝病（n = 9）和其他（n = 3），依据组织病理学检查结果。巨块型肝细胞癌亚型（n = 23）最为常见。

3.2 | 犬类肝脏组织中的 pSTAT3

3.2.1 | 蛋白质印迹法

正常犬类肝脏组织和肝细胞癌（HCC）组织中均显示出免疫反应性带，其大小与预期相符（分别为 79 和 86 千道尔顿），表明该抗体与犬类肝脏组织具有交叉反应性。β-肌动蛋白被用作上样对照，表明与正常肝脏组织相比，HCC 组织中的 STAT3 高度磷酸化（图 2）。

3.2.2 | 免疫组织化学

针对 pSTAT3 的免疫组织化学染色主要在肿瘤性肝细胞的细胞核中被观察到（图 3A、B）

所有正常的肝组织中 pSTAT3 免疫染色均为阴性（表 2；图 3D）。非肿瘤性肝疾病组织的免疫组化染色强度高于正常肝组织，但与肝细胞癌（HCC）相比则较低（图 3A-D）。这种模式具有统计学意义（p<0.001）（表 2）。随着肝组织表现出致癌性，pSTAT3 免疫染色强度增加。

具有特异性 pSTAT3 核免疫染色的犬 AGASACA 组织作为阳性对照（图 3E）[21]。在阴性对照中，pSTAT3 未出现免疫染色（图 3F）。

表 1 | 本研究纳入犬只的临床变量。

	正常肝脏（n = 5）	非肿瘤性肝病（n = 30）	肝细胞癌（n = 28）
中位年龄（范围）	1	10.5（6-15）	12.5（8-17）
性别（n）	雄性（5） 去势雄性（0） 雌性（0） 绝育雌性（0）	雄性（1） 去势雄性（15） 雌性（4） 绝育雌性（10）	雄性（0） 去势雄性（16） 雌性（0） 绝育雌性（12）
品种（n）	巴吉度犬（5）	马耳他犬（10 只） 西施犬（4 只） 玩具贵宾犬（4 只） 约克夏梗（4 只） 混种犬（2 只） 博美犬（2 只） 阿拉斯加雪橇犬（1 只） 柯基犬（1 只） 金毛寻回犬（1 只） 雪纳瑞犬（1 只）	马耳他犬（7 只） 混种犬（5 只） 西施犬（3 只） 玩具贵宾犬（3 只） 柯克犬（2 只） 雪纳瑞犬（2 只） 史宾格犬（2 只） 约克夏梗（1 只） 腊肠犬（1 只） 法国斗牛犬（1 只） 博美犬（1 只）
组织学类型（n）	——	炎症（18） 肝细胞空泡变性（9） 其他（3）
形态学类型（n）	—— —— ——	—— —— ——	大量（23） 结节状（4） 广泛性（1）

图 2 | 在犬类肝细胞癌（HCC）中，STAT3 高度磷酸化。用于检测犬类正常肝脏组织和 HCC 组织中总 STAT3 和磷酸化 STAT3 的免疫印迹图谱。β-肌动蛋白（42kDa）被用作上样对照。

3.3 | pSTAT3 免疫染色与临床病理因素之间的关联

表 3 展示了 pSTAT3 免疫染色与临床病理因素之间的关联。高 pSTAT3 免疫染色组（12 岁）的中位年龄与低 pSTAT3 免疫染色组（11 岁）相似。根据年龄划分的 pSTAT3 免疫染色水平差异无统计学意义（p = 0.236）。在 HCC 组中，肿瘤直径大于 5 厘米以及转移（这些是预后不良的已知指标）与高 pSTAT3 免疫染色相关[18, 23]。然而，pSTAT3 免疫染色与 ALT、AST、GGT 水平或肿瘤位置（这些与预后相关）之间无显著关联（表 3）[17, 18]。

3.4 | 生存曲线

采用 Kaplan-Meier 分析方法，探究了 HCC 组中 pSTAT3 免疫组化染色结果、无病生存期（DFS）以及总生存期（OS）之间的关联。在 HCC 组的 28 只犬中，有 15 只犬在研究结束时存活或没有进一步的医疗记录可供参考，另外 13 只犬死亡。其中，有 2 只犬因其他原因死亡。中位无病生存期为 10.5 个月，中位总生存期为 13.5 个月。根据 pSTAT3 免疫组化染色水平，HCC 组被分为两组：高表达组（n = 18）和低表达组（n = 10）。在 DFS 分析中，有 14 只犬在研究结束时未出现转移或复发，另外 2 只犬在没有转移或复发的情况下死亡。所有这些犬都被视为失访。在 OS 研究中，总体而言，有 17 只动物被失访。其中，15 只动物存活至本研究结束或失访，另外 2 只动物因慢性肾病和短头畸形综合征死亡。

图 3 | 用 3,3'-二氨基联苯胺对犬肝组织进行免疫组织化学染色，并用苏木精进行复染。

（A、B）肝细胞癌。 （C）非肿瘤性肝病组织。 （D）正常肝组织。 （E）阳性对照，犬肛腺腺癌组织中观察到 pSTAT3 免疫染色阳性。 （F）阴性对照，犬肝细胞癌组织未观察到特异性染色。（A、C-F：原放大倍数×400，B：原放大倍数×1000）

表 2 | 正常肝脏、非肿瘤性肝病及肝细胞癌中 pSTAT3 的免疫组化染色。

pSTAT3 免疫组化染色（阳性细胞数 [%]）	正常肝脏 （n = 10）	非肿瘤性肝病 （n = 30）	HCC (n = 28)	p
低 得分1 得分2	10（100） 10 0	25（83） 19 6	10（36） 2 8	p < 0.001* ：低剂量组与高剂量组相比
高 得分3 得分4	0（0） 0 0	5（17） 5 0	18（64） 6 12

缩写：HCC，肝细胞癌。

*p<0.05，表明肿瘤致癌性与 pSTAT3 免疫染色之间存在统计学意义的线性关联。

无病生存期（DFS）和总生存期（OS）的生存曲线显示，与 pSTAT3 免疫染色呈统计学显著相关（图 4）。高 pSTAT3 免疫染色（n = 18）与较差的 DFS 和 OS 相关。在高 pSTAT3 免疫染色组中，1 年的 DFS 和 OS 生存率分别为 49.4% 和 64.8%。然而，在低免疫染色组中未观察到复发、转移或死亡病例。

4 | 讨论

在本研究中，我们通过蛋白质印迹法和免疫组织化学法确认并比较了犬类肝脏组织中 pSTAT3 的蛋白水平。这是首次对几种犬类肝脏组织中的 pSTAT3 蛋白进行评估的研究。STAT3 有两种亚型，即 STAT3α 和 STAT3β [24, 25]。我们的研究证实，在正常组织和肝细胞癌（HCC）组织中，STAT3 和 pSTAT3 的免疫反应性条带分别位于约 79kDa（STAT3α）和 86kDa（STAT3β），并且通过蛋白质印迹法证实了在 HCC 中亚型差异的存在。激活的 STAT3α 在多项研究中与致癌发生和肿瘤进展相关联[26, 27]。然而，pSTAT3β 的功能引起了关注，因为它作为一种肿瘤抑制因子而发挥作用[26]。然而，有报告表明，pSTAT3β 参与 STAT3α 的磷酸化上调和核滞留的上调[28]。然而，本研究仅对每种组织进行了一项研究。尽管如此，我们通过蛋白质印迹法确认了 pSTAT3 抗体在犬类肝脏组织中的交叉反应性，并通过蛋白质印迹法证实了 HCC 组织中 STAT3 的过度激活。我们建议进一步研究 pSTAT3α 和 pSTAT3β 在犬类 HCC 中的作用。

在人类肝细胞癌（HCC）中，pSTAT3 免疫染色显著高于相邻的非肿瘤性肝组织[22]。

此外，犬类弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中的 pSTAT3 免疫染色高于正常或反应性淋巴结[13]。我们的数据表明，pSTAT3 免疫染色依次增加于以下顺序：正常肝脏、非肿瘤性肝病和 HCC。在患有肝炎和肝硬化的狗的肝脏再生过程中，pSTAT3 蛋白增加[29]。然而，通过抑制细胞因子信号传导 3 而过度激活和高活性的 STAT3 与肝切除小鼠中的 HCC 进展相关[30]，并且肝脏中的炎症和空泡性肝病被怀疑与癌变有关[16, 31, 32]。这些研究表明，在犬类肝脏中过度激活的 STAT3 导致肿瘤形成，并且非肿瘤性肝病可能与癌变有关。JAK 和 STAT 通路在人类 HCC 发病机制中起着关键作用[33]，并且在犬类脾脏血管肉瘤、甲状腺癌、肥大细胞肿瘤和 AGASACA 中已被鉴定[34]。对于犬类 HCC，假定存在类似的机制；然而，还需要进一步的研究。

根据以往的研究，有关犬类乳腺肿瘤和肥大细胞肿瘤的研究表明，在转移性肿瘤中，pSTAT3 免疫染色水平更高[34, 35]。此外，在犬类皮肤肥大细胞肿瘤中，泼尼松龙治疗后肿瘤体积显著缩小与 pSTAT3 水平降低有关[14]。而且，在我们的犬类肝细胞癌（HCC）病例中，我们观察到高 pSTAT3 免疫染色与肿瘤大小和转移之间的关联。这些发现可以通过 STAT3 过度激活在抗凋亡、细胞增殖、侵袭和迁移中的作用来解释[36， 37]。此外，肿瘤体积过大（>5 厘米）和转移与不良预后相关[18， 23]。我们的数据表明，高 pSTAT3 免疫染色与较差的无病生存期（DFS）和总生存期（OS）相关。一项关于 pSTAT3 与人类 HCC 关联的荟萃分析显示，STAT3 过度激活与较低的 DFS 和 3 年、5 年 OS 相关[11]。此外，包括人类骨肉瘤、肺腺癌和肾细胞癌在内的各种恶性肿瘤的研究也报告了 STAT3 过度激活与不良预后之间的相关性[5， 7， 9]。同样，在犬类黑色素瘤病例中，pSTAT3 阴性肿瘤患者的中位生存率高于阳性肿瘤患者 [15]。这些结果表明，pSTAT3 可能是多种肿瘤预后情况的可靠生物标志物。因此，我们的研究表明，pSTAT3 蛋白可用作犬类肝细胞癌预后的标志物。

表 3 | pSTAT3 免疫组化染色与临床病理因素之间的关联。

	组织数量	pSTAT3 免疫染色		总体 p 值
		低	高
中位年龄（范围）（岁）		11（6 - 17）	12（6 - 15）	p = 0.236
肝脏疾病 空泡性肝病 炎症 其他	9 18 3	8 14 3	1 4 0	p = 0.794
肝细胞癌 亚型 巨块型 结节型 弥漫型 肿瘤位置 左分支 中央分支 右分支 肿瘤大小 ≤5 厘米 >5 厘米 血液分析 ALT 正常 升高 AST 正常 升高 ALP 正常 升高 GGT 正常 升高 转移/扩散 是 否	23 4 1 20 5 3 5 23 8 20 15 13 3 25 8 20 14 14	8 2 0 8 2 0 4 6 5 5 5 5 0 10 1 9 8 2	15 2 1 12 3 3 1 17 3 15 10 8 3 15 7 11 6 12	p = 0.751 p = 0.679 p = 0.041* p = 0.091 p = 1.000 P=0.533 P=0.194 p = 0.046*

缩写：ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；GGT，γ-谷氨酰转移酶；HCC，肝细胞癌。

*p<0.05，表明高 pSTAT3 免疫染色与临床病理因素之间存在统计学显著关联。

 

图 4 | 基于 pSTAT3 免疫染色的 28 只肝细胞癌（HCC）犬的无病生存期（A）和总体生存期（B）的 Kaplan-Meier 生存曲线。未纳入分析的犬只用小竖线标记表示。*p<0.05，表明 pSTAT3 免疫染色与之存在统计学显著关联。

索拉非尼是首个获批用于人类不可切除肝细胞癌（HCC）治疗的小分子抑制剂，目前也被用作治疗伴有血管侵犯或肝外转移的人类 HCC 的一种治疗选择[38, 39]。此外，索拉非尼能够降低 STAT3 的磷酸化水平[40]。在本研究中，我们证实了犬类 HCC 中 STAT3 的磷酸化水平升高，这与肿瘤大小和转移有关。因此，本研究提供了进一步证据表明索拉非尼可以作为不可切除犬类 HCC 的治疗选择[41]。此外，目前针对人类 HCC 的众多研究正在探索靶向 STAT3 激活和 JAK-STAT 通路以用于癌症治疗[42]。这些研究表明，pSTAT3 是犬类 HCC 的下一个靶向治疗策略。

本研究的一个局限性在于每组中的犬只数量较少，因此，在肝细胞癌（HCC）组中，一些临床病理因素，尤其是亚型、肿瘤位置、肿瘤大小和γ-谷氨酰转移酶（GGT）的分布存在不对称性。尽管部分数据具有统计学意义，但增加犬只数量将有助于获得更可靠的结果，并实现多角度分析。此外，患有正常肝脏组织的犬只和患有肝脏疾病或肝细胞癌（HCC）的犬只之间存在年龄差异。患有正常肝脏的犬只（1 岁）比患有非肿瘤性肝病和 HCC 的犬只年龄较小。然而，从没有其他疾病的年长犬只身上获取正常肝脏组织具有一定的难度。在未来的研究中，确保所有组之间的年龄分布具有可比性至关重要。

总之，本研究通过蛋白质印迹法和免疫组织化学法在多种犬类肝脏组织中检测到了 pSTAT3。与正常犬类肝脏组织和非肿瘤性肝病组织相比，肝细胞癌（HCC）组织中的 STAT3 活化程度更高。此外，我们证实了 HCC 中高 pSTAT3 免疫染色与肿瘤大小、转移情况以及无病生存期（DFS）和总生存期（OS）不良之间存在统计学相关性。因此，我们的研究结果表明 pSTAT3 可用作预后标志物。然而，还需要进一步的研究来阐明其在 HCC 发展中的机制和作用。

致谢

本研究由韩国农村发展局下属的伴侣动物研究中心合作研究项目资助（项目编号：PJ01499001）。首尔国立大学兽医学院研究机构为本研究的出版费用提供了支持。

伦理声明

所采用的实验方案和操作流程均经过了首尔国立大学（SNU）机构动物护理与使用委员会的伦理审查并获得批准（SNU-240301-1）。实验严格按照相关机构及国家关于实验动物护理和使用的指导方针及规定进行。患有肝病的犬只主人被告知了本研究的流程和目的，并且他们已签署了知情同意书。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性声明

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